Suyuq xromatografiya xom ashyo, oraliq mahsulotlar, preparatlar va qadoqlash materiallaridagi har bir komponentning tarkibini va aralashmalarni tekshirishning asosiy usuli hisoblanadi, ammo ko'plab moddalar tayanish uchun standart usullarga ega emas, shuning uchun yangi usullarni ishlab chiqish muqarrar. Suyuq faza usullarini ishlab chiqishda xromatografik ustun suyuqlik xromatografiyasining yadrosidir, shuning uchun mos xromatografik ustunni qanday tanlash juda muhimdir. Ushbu maqolada muallif uch jihatdan suyuq xromatografiya ustunini qanday tanlashni tushuntiradi: umumiy g'oyalar, mulohazalar va qo'llash doirasi.
A. Suyuq xromatografiya ustunlarini tanlash bo'yicha umumiy g'oyalar
1. Tahlil qiluvchi moddaning fizik va kimyoviy xususiyatlarini baholang: kimyoviy tuzilish, eruvchanlik, barqarorlik (masalan, oksidlanish / pasaytirish / gidrolizlanish osonmi), kislotalilik va ishqoriylik va boshqalar, ayniqsa kimyoviy tuzilish kalitidir. konjugatsiyalangan guruh kabi xususiyatlarni aniqlash omili kuchli ultrabinafsha singishi va kuchli floresanga ega;
2. Tahlilning maqsadini aniqlang: yuqori ajratish, yuqori ustun samaradorligi, qisqa tahlil vaqti, yuqori sezuvchanlik, yuqori bosimga chidamlilik, ustunning uzoq umri, arzonligi va boshqalar kerakmi;
- Tegishli xromatografik ustunni tanlang: xromatografik plomba moddasining tarkibini, fizik va kimyoviy xususiyatlarini, masalan, zarrachalar hajmini, gözenek hajmini, haroratga chidamliligini, pH bardoshliligini, analitning adsorbsiyasini va boshqalarni tushuning.
- Suyuqlik xromatografiyasi ustunlarini tanlash bo'yicha fikrlar
Ushbu bobda xromatografiya ustunining fizik va kimyoviy xossalari nuqtai nazaridan xromatografiya ustunini tanlashda e'tiborga olinadigan omillar muhokama qilinadi. 2.1 To'ldiruvchi matritsasi
2.1.1 Silikagel matritsasi Ko'pgina suyuq xromatografiya ustunlarining to'ldiruvchi matritsasi silikageldir. Ushbu turdagi plomba moddasi yuqori tozaligi, arzonligi, yuqori mexanik kuchiga ega va guruhlarni o'zgartirish oson (masalan, fenil bog'lanishi, aminokislota bog'lanishi, siyano bog'lanishi va boshqalar), lekin u toqat qiladigan pH qiymati va harorat oralig'i cheklangan: Ko'pgina silika jeli matritsa to'ldiruvchilarining pH diapazoni 2 dan 8 gacha, lekin maxsus o'zgartirilgan silika jeli bilan bog'langan fazalarning pH diapazoni shunchalik keng bo'lishi mumkin. 1,5 dan 10 gacha, shuningdek, past pH da barqaror bo'lgan maxsus modifikatsiyalangan silika jeli bilan bog'langan fazalar mavjud, masalan, pH 1 dan 8 gacha barqaror bo'lgan Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18; silika gel matritsasining yuqori harorat chegarasi odatda 60 ℃ ni tashkil qiladi va ba'zi xromatografiya ustunlari yuqori pH da 40 ℃ haroratga bardosh bera oladi.
2.1.2 Polimer matritsasi Polimer plomba moddalari asosan polistirol-divinilbenzol yoki polimetakrilatdir. Ularning afzalliklari shundaki, ular keng pH diapazoniga toqat qila oladilar - ular 1 dan 14 gacha bo'lgan oraliqda ishlatilishi mumkin va ular yuqori haroratga nisbatan ancha chidamli (80 ° C dan yuqori bo'lishi mumkin). Silika asosidagi C18 plomba moddalari bilan solishtirganda, bu turdagi plomba moddasi kuchli hidrofobiklikka ega va makro gözenekli polimer oqsillar kabi namunalarni ajratishda juda samarali. Kamchiliklari shundaki, kolonnaning samaradorligi pastroq va mexanik quvvati silika asosidagi plomba moddalariga qaraganda zaifdir. 2.2 Zarrachalar shakli
Ko'pgina zamonaviy HPLC plomba moddalari sharsimon zarralardir, lekin ba'zida ular tartibsiz zarralardir. Sferik zarralar pastki ustun bosimi, yuqori ustun samaradorligi, barqarorligi va uzoq umrini ta'minlashi mumkin; yuqori viskoziteli mobil fazalardan foydalanganda (masalan, fosfor kislotasi) yoki namuna eritmasi yopishqoq bo'lsa, tartibsiz zarralar kattaroq o'ziga xos sirt maydoniga ega bo'lib, bu ikki fazaning to'liq ta'siriga ko'proq yordam beradi va narx nisbatan past. 2.3 Zarrachalar hajmi
Zarrachalar hajmi qanchalik kichik bo'lsa, ustunning samaradorligi va ajralish qanchalik yuqori bo'lsa, lekin yuqori bosim qarshiligi qanchalik yomon bo'lsa. Eng ko'p ishlatiladigan ustun 5 mkm zarracha kattaligi ustuni; agar ajratish talabi yuqori bo'lsa, 1,5-3 mikronli plomba moddasini tanlash mumkin, bu ba'zi murakkab matritsa va ko'p komponentli namunalarni ajratish muammosini hal qilish uchun qulaydir. UPLC 1,5 mkm plomba moddalaridan foydalanishi mumkin; 10 mkm yoki undan katta zarracha o'lchamli plomba moddalari ko'pincha yarim tayyorlovchi yoki preparativ ustunlar uchun ishlatiladi. 2.4 Uglerod tarkibi
Uglerod tarkibi silika jeli yuzasida bog'langan fazaning ulushini anglatadi, bu o'ziga xos sirt maydoni va bog'langan faza qoplamasi bilan bog'liq. Yuqori uglerod tarkibi yuqori ustun sig'imi va yuqori piksellar sonini ta'minlaydi va ko'pincha yuqori ajratishni talab qiladigan murakkab namunalar uchun ishlatiladi, lekin ikki faza o'rtasidagi uzoq o'zaro ta'sir vaqti tufayli tahlil vaqti uzoq; past uglerodli tarkibli xromatografik ustunlar qisqaroq tahlil vaqtiga ega va turli xil selektivlikni ko'rsatishi mumkin va tez-tez tez tahlil qilishni talab qiladigan oddiy namunalar va yuqori suvli faza sharoitlarini talab qiladigan namunalar uchun ishlatiladi. Odatda, C18 ning uglerod miqdori 7% dan 19% gacha. 2.5 Teshik hajmi va o'ziga xos sirt maydoni
HPLC adsorbsion muhiti g'ovakli zarralar bo'lib, ko'pincha o'zaro ta'sirlar teshiklarda sodir bo'ladi. Shuning uchun molekulalar adsorbsiyalanadigan va ajraladigan teshiklarga kirishi kerak.
Teshik hajmi va o'ziga xos sirt maydoni ikkita bir-birini to'ldiruvchi tushunchadir. Kichik gözenek hajmi katta o'ziga xos sirt maydonini anglatadi va aksincha. Katta o'ziga xos sirt maydoni namuna molekulalari va bog'langan fazalar o'rtasidagi o'zaro ta'sirni oshirishi, ushlab turishni kuchaytirishi, namunani yuklash va ustun sig'imini oshirishi va murakkab tarkibiy qismlarni ajratishi mumkin. To'liq gözenekli plomba moddalari bu turdagi plomba moddalariga tegishli. Yuqori ajratish talablari bo'lganlar uchun katta o'ziga xos sirt maydoni bo'lgan plomba moddalarini tanlash tavsiya etiladi; kichik o'ziga xos sirt maydoni orqa bosimni kamaytirishi, ustun samaradorligini oshirishi va gradient tahliliga mos keladigan muvozanat vaqtini kamaytirishi mumkin. Ushbu turdagi plomba moddalariga yadro qobig'i to'ldiruvchilar kiradi. Ajratishni ta'minlash uchun tahlil samaradorligi yuqori bo'lganlar uchun kichik o'ziga xos sirt maydoni bo'lgan plomba moddalarini tanlash tavsiya etiladi. 2.6 Teshik hajmi va mexanik mustahkamligi
G'ovak hajmi, shuningdek, "g'ovak hajmi" sifatida ham tanilgan, birlik zarrachadagi bo'shliq hajmining o'lchamini bildiradi. Bu plomba moddasining mexanik kuchini yaxshi aks ettirishi mumkin. Katta g'ovak hajmiga ega bo'lgan plombalarning mexanik mustahkamligi kichik gözenek hajmiga ega bo'lgan plomba moddalariga qaraganda bir oz zaifdir. Ko'pincha g'ovak hajmi 1,5 ml/g dan kam yoki unga teng bo'lgan plomba moddalari HPLC ajratish uchun ishlatiladi, g'ovak hajmi 1,5 ml/g dan ortiq bo'lgan plomba moddalar esa asosan molekulyar eksklyuziv xromatografiya va past bosimli xromatografiya uchun ishlatiladi. 2.7 Cheklash darajasi
Qopqoqlash birikmalar va ta'sir qilingan silanol guruhlari o'rtasidagi o'zaro ta'sir natijasida hosil bo'lgan qoldiq cho'qqilarini kamaytirishi mumkin (masalan, ishqoriy birikmalar va silanol guruhlari o'rtasidagi ionli bog'lanish, Van der Vaals kuchlari va kislotali birikmalar va silanol guruhlari o'rtasidagi vodorod aloqalari), shu bilan ustun samaradorligi va cho'qqi shaklini yaxshilaydi. . Qopqoqsiz bog'langan fazalar, ayniqsa, qutbli namunalar uchun yopiq bog'langan fazalarga nisbatan turli xil selektivlikni keltirib chiqaradi.
- Turli xil suyuqlik xromatografiya ustunlarini qo'llash doirasi
Ushbu bobda ba'zi hollarda suyuq xromatografiya ustunlarining har xil turlarini qo'llash doirasi tavsiflanadi.
3.1 Teskari fazali C18 xromatografik ustun
C18 ustuni eng ko'p ishlatiladigan teskari fazali ustun bo'lib, u ko'pchilik organik moddalarning tarkibi va nopoklik sinovlariga javob berishi mumkin va o'rta qutbli, zaif qutbli va qutbsiz moddalarga nisbatan qo'llaniladi. C18 xromatografik ustunining turi va spetsifikatsiyasi alohida ajratish talablariga muvofiq tanlanishi kerak. Masalan, yuqori ajratish talablari bo'lgan moddalar uchun 5 mkm * 4,6 mm * 250 mm spetsifikatsiyalar tez-tez ishlatiladi; murakkab ajratish matritsalari va shunga o'xshash qutbli moddalar uchun 4 mkm * 4,6 mm * 250 mm spetsifikatsiyalar yoki kichikroq zarracha o'lchamlari ishlatilishi mumkin. Misol uchun, muallif selekoksib APIdagi ikkita genotoksik aralashmani aniqlash uchun 3 mkm * 4,6 mm * 250 mm ustundan foydalangan. Ikki moddaning ajralishi 2,9 ga yetishi mumkin, bu juda yaxshi. Bundan tashqari, ajratishni ta'minlash sharti ostida, agar tezkor tahlil qilish kerak bo'lsa, ko'pincha 10 mm yoki 15 mm qisqa ustun tanlanadi. Misol uchun, muallif LC-MS/MS dan piperakin fosfat API da genotoksik aralashmani aniqlash uchun foydalanganda, 3 mkm * 2,1 mm * 100 mm ustun ishlatilgan. Nopoklik va asosiy komponent o'rtasidagi ajralish 2,0 ni tashkil etdi va namunani aniqlash 5 daqiqada yakunlanishi mumkin. 3.2 Teskari fazali fenil ustuni
Fenil ustuni ham teskari fazali ustunning bir turidir. Ushbu turdagi ustunlar aromatik birikmalar uchun kuchli selektivlikka ega. Oddiy C18 ustuni bilan o'lchangan aromatik birikmalarning reaktsiyasi zaif bo'lsa, siz fenil ustunini almashtirish haqida o'ylashingiz mumkin. Misol uchun, men selekoksib API ishlab chiqarganimda, bir xil ishlab chiqaruvchining fenil ustuni va bir xil spetsifikatsiya (barcha 5 mkm * 4,6 mm * 250 mm) tomonidan o'lchangan asosiy komponent javobi C18 ustunidan taxminan 7 baravar ko'p edi. 3.3 Oddiy fazali ustun
Teskari fazali ustunga samarali qo'shimcha sifatida normal fazali ustun yuqori qutbli birikmalar uchun javob beradi. Agar teskari fazali ustunda 90% dan ortiq suvli faza bilan elutsiya qilishda cho'qqi hali ham juda tez bo'lsa va hatto erituvchi cho'qqisiga yaqin bo'lsa va u bilan bir-biriga to'g'ri kelsa, siz normal fazali ustunni almashtirish haqida o'ylashingiz mumkin. Ushbu turdagi ustunlarga hilik ustun, aminokislotalar, siyano ustunlar va boshqalar kiradi.
3.3.1 Hilik ustuni Hilik ustuni odatda qutbli moddalarga reaktsiyani kuchaytirish uchun bog'langan alkil zanjiriga hidrofil guruhlarni joylashtiradi. Ushbu turdagi ustunlar shakar moddalarini tahlil qilish uchun javob beradi. Muallif bu turdagi ustundan ksiloza va uning hosilalari tarkibini va unga aloqador moddalarni bajarishda foydalangan. Ksiloza hosilasining izomerlari ham yaxshi ajratilishi mumkin;
3.3.2 Amino ustuni va siyano ustuni Amino ustuni va siyano ustuni maxsus moddalar uchun selektivlikni yaxshilash uchun bog'langan alkil zanjirining oxirida mos ravishda aminokislota va siyano modifikatsiyalarining kiritilishiga ishora qiladi: masalan, aminokislota ustuni yaxshi tanlovdir. shakar, aminokislotalar, asoslar va amidlarni ajratish uchun; siyano ustuni konjuge bog'lanishlar mavjudligi sababli vodorodlangan va gidrogenlanmagan strukturaviy o'xshash moddalarni ajratishda yaxshiroq selektivlikka ega. Amino ustun va siyano ustuni odatda oddiy faza ustuni va teskari faza ustuni o'rtasida almashtirilishi mumkin, lekin tez-tez almashtirish tavsiya etilmaydi. 3.4 Chiral ustun
Chiral ustun, nomidan ko'rinib turibdiki, chiral birikmalarni ajratish va tahlil qilish uchun, ayniqsa farmatsevtika sohasida mos keladi. An'anaviy teskari faza va normal faza ustunlari izomerlarni ajratishga erisha olmasa, bu turdagi ustunni ko'rib chiqish mumkin. Masalan, muallif 1,2-difeniletilendiaminning ikkita izomerini ajratish uchun 5 mkm * 4,6 mm * 250 mm xiral ustundan foydalangan: (1S, 2S)-1, 2-difeniletilendiamin va (1R, 2R) -1, 2. -difeniletillendiamin va ularning orasidagi ajralish taxminan 2,0 ga etdi. Biroq, chiral ustunlar boshqa turdagi ustunlarga qaraganda qimmatroq, odatda 1W + / dona. Agar bunday ustunlarga ehtiyoj bo'lsa, birlik etarli byudjetni yaratishi kerak. 3.5 Ion almashinuvi ustuni
Ion almashinuvi ustunlari ionlar, oqsillar, nuklein kislotalar va ba'zi shakar moddalari kabi zaryadlangan ionlarni ajratish va tahlil qilish uchun javob beradi. To'ldiruvchi turiga ko'ra ular kation almashinadigan ustunlarga, anion almashinadigan ustunlarga va kuchli kation almashinadigan ustunlarga bo'linadi.
Kation almashinuvi ustunlari asosan aminokislotalar kabi katyonik moddalarni tahlil qilish uchun mos bo'lgan kaltsiy va vodorod asosidagi ustunlarni o'z ichiga oladi. Misol uchun, muallif kaltsiy glyukonat va kaltsiy asetatni yuvish eritmasida tahlil qilishda kaltsiy asosidagi ustunlardan foydalangan. Ikkala modda ham l = 210nm da kuchli javoblarga ega bo'lib, ajralish darajasi 3,0 ga yetdi; muallif glyukoza bilan bog'liq moddalarni tahlil qilishda vodorod asosidagi ustunlardan foydalangan. Bir nechta asosiy tegishli moddalar - maltoza, maltotrioza va fruktoza - differensial detektorlar ostida yuqori sezuvchanlikka ega bo'lib, aniqlash chegarasi 0,5 ppm va ajratish darajasi 2,0-2,5 edi.
Anion almashinuv ustunlari asosan organik kislotalar va halogen ionlari kabi anion moddalarni tahlil qilish uchun javob beradi; kuchli kation almashinadigan ustunlar yuqori ion almashinuv qobiliyatiga va selektivlikka ega va murakkab namunalarni ajratish va tahlil qilish uchun javob beradi.
Yuqoridagilar muallifning o'z tajribasi bilan birlashtirilgan bir nechta umumiy suyuqlik xromatografiya ustunlarining turlari va qo'llanilishi diapazonlariga kirishdir. Haqiqiy ilovalarda xromatografik ustunlarning boshqa maxsus turlari mavjud, masalan, katta gözenekli xromatografik ustunlar, kichik gözenekli xromatografik ustunlar, yaqinlik xromatografiya ustunlari, multimodli xromatografik ustunlar, ultra yuqori samarali suyuqlik xromatografiya ustunlari (UHPLC), superkritik suyuqlik xromatografiya ustunlari ( SFC) va boshqalar. Ular turli sohalarda muhim rol o'ynaydi. Xromatografik ustunning o'ziga xos turi namunaning tuzilishi va xususiyatlariga, ajratish talablariga va boshqa maqsadlarga qarab tanlanishi kerak.
Xabar berish vaqti: 2024 yil 14-iyun